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Targeted gene disruption에 의한 citrinin 비생산 홍국균의 개발

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표제/저자사항
Targeted gene disruption에 의한 citrinin 비생산 홍국균의 개발
이인형 creator
발행사항
국민대학교
형태사항
HTML
주기사항
◆ 연구목표Monascus 속 곰팡이(홍국균)는 식품색소로 이용되는 천연색소와 콜레스테롤 합성 저해제로 작용하는 monacolin K 등 유용한 이차대사산물을 생산하지만 신장 및 간독으로 작용하는 citrinin을 생산하여 산업적 이용이 문제가 되고 활용에 제약을 받고 있다. 천연식품색소의 생산 및 고지혈증 치료용 기능성식품의 개발 등에 Monascus 속 곰팡이의 활용을 극대화하기 위해서 targeted gene disruption에 의해 citrinin을 생성하지 않는 Monascus속 곰팡이의 개발 기술의 확립이 본 연구의 목표이다.◆ 연구내용 및 방법Citrinin 비생산 Monascus를 개발하기 위해 적용된 연구방법은 아래와 같다.가. Monascus의 분자유전학적 연구기술 확립○ Cosmid vector pMOcosX를 이용하여 cosmid genomic library를 구축함○ Aspergilus nidulans trpC 유전자의 promoter와 terminator 또는 Monascus anka glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gpd) 유전자 promoter와 Escherichia coli의 hygromycin B resistance (hph)유전자를 이용하여 M. ruber 형질전환 vector 개발○ 형질전환방법의 확립나. Citrinin 비생산 Monascus의 개발○ PCR에 의한 PKS 유전자 분리를 위한 탐침 개발○ Genomic library screening에 의한 citrinin 생합성 PKS 유전자의 cloning○ Citrinin 생합성 유전자를 flanking sequence로 이용하여 disruption vector 구축○ Agrobacterium법에 의해 형질전환하여 citrinin 생합성 PKS 유전자 disruption○ Bioassay, TLC, HPLC에 의해 citrinin 비생산 균주의 확인◆ 연구결과 및 기대효과색소, monacolin K, citrinin 생성이 확인된 M. ruber KCTC6122를 모델균주로 하여 분자 유전학적기술을 개발하여 Monascus에서의 분자유전학적 연구의 토대를 마련하였으며 PKS 유전자 특이 탐침을 개발하여 구축된 genomic library screening에 의해 citrinin 생합성 유전자의 cloning에 대한 연구가 진행 중이다. Citrinin 생합성 유전자를 flanking sequence로 하여 disruption vector를 구축하고 Agrobacterium법을 이용하여 형질전환하여 citrinin 비생산 균주를 개발에 대한 연구를 계속할 것이다.홍국균은 현재 균족으로 약 20종, 균주로서 약 70종류가 분리 되어 있는데 색소, citrinin, monacolin K의 생성정도가 균에 따라 매우 상이함으로 본 과제를 통하여 개발된 기술은 색소나 monacolin K 생산능은 좋지만 citrinin 생산 때문에 문제가 되는 Monascus 속 곰팡이에 활용되어 홍국균의 천연 식품색소의 생산 및 고지혈증 치료용 기능성 식품의 개발 등 산업적 이용이 극대화될 것이다.현재까지 Monascus에 대한 연구는 citrinin 비생산 균주의 선발 및 돌연변이법에 의한 citrinin 비생산 균주 개발, citrinin 비생산 또는 저생산 발효조건의 확립에 초점을 맞추고 있으나 본 연구는 분자유전학적 수준에서의 연구를 시도한 차별성 있는 연구이다.가. Monascus 속 곰팡이의 분자유전학적 연구기술 확립○ Cosmid vector pMOcosX를 이용하여 2400 clone으로 구성된 indexed genomic library를 구축하였다.○ Aspergilus nidulans trpC 유전자의 promoter와 terminator 또는 Monascus anka glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(gpd) 유전자 promoter와 Escherichia coli의 hygromycin B resistance (hph) 가 재조합된 vector를 형질전환하여 hph 유전자의 발현을 확인하여 M. ruber 형질전환 vector를 확보하였다.○ Protoplast의 electrporation 법, biolistic bombardment 법, Agrobacterium 법을 시도하여 효율적이고 안정된 형질전환체를 생성하는 Agrobacterium에 의한 M. ruber의 형질전환법을 확립하였다.나. Citrinin 비생산 Monascus의 개발○ 13종의 사상성 진균 PKS의 아미노산 서열을 분석하여 β-ketoacylsynthase (KS) domain으로부터 PCR primer를 제작하여 80% 이상의 상동성을 보이는 PKS 특이 탐침을 개발하였다.○ 개발된 PKS 특이 탐침을 이용하여 genomic library screening에 의한 citrinin 생합성 PKS 유전자의 cloning에 대한 연구가 진행 중이며, citrinin 생합성 유전자를 flanking sequence로 이용하여 disruption vector 구축한 후 Agrobacterium법에 의해 형질전환하여 citrinin 생합성 PKS 유전자 disruption에 대한 연구를 계속할 것이다.○ Bacillus cereus를 이용한 bioassay, TLC, HPLC에 의해 citrinin 비생산 여부를 확인할 수 있는 방법을 확립하였다.
원저자료: http://click.ndsl.kr/servlet/LinkingFullTextView?cn=TRKO201300001996&koi=KISTI2.1015/RPT.TRKO201300001996&org_code=O170&site_code=SS1315&dbt=TRKO&service_code=01
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